Strukturelle Charakterisierung der C-terminalen Endodomane des hP2X7-Rezeptors Der P2X7-Rezeptor (P2X7R) gehort zur P2X-Rezeptorfamilie ATP-gesteuerter Kationenkanale. Die sieben Isoformen (P2X1-P2X7) teilen eine gemeinsame Topologie mit zwei Transmembranregionen, einer großen extrazellularen Schleife und intrazellularen N- und C-terminalen Domanen. Drei Untereinheiten einer Isoform assemblieren zu einem funktionellen homotrimeren Rezeptor. Aufgrund seiner Lokalisation in Zellen mit Beteiligung an Schmerzentstehung, Entzundungsprozessen und neurodegenerativen Erkrankungen ist der P2X7R ein interessanter Angriffspunkt fur die Entwicklungen neuer Arzneimittel gegen verschiedene Krankheiten. Strukturell unterscheidet sich die 595 Aminosauren umfassende P2X7R-Untereinheit von anderen P2XR-Subtypen (P2X1R-P2X6R) durch eine um 120-200 Aminosauren langere C-terminale Endodomane. Funktionelle und biochemische Daten, die von unserer Arbeitsgruppe zusammen mit der Arbeitsgruppe von Prof. Markwardt in Halle publiziert wurden (Becker et al., 2008), lassen den Schluss zu, dass die C-terminale Endodomane des P2X7-Rezeptors ein Gating-Modul darstellt, wobei eine trimere Anordnung des Moduls zur trimeren Struktur der P2X7-Rezeptoren passen wurde. Modelle, wie solche cytoplasmatische Domanen das Offnen von Ionenkanalen regulieren, wurden bereits fur spannungsabhangige K+-Kanale durch Kombination funktioneller Daten mit Kristallographie- Strukturdaten abgeleitet. Die C-terminale Endodomane des hP2X7-Rezeptors (hP2X7 355-595- Protein) wurde in dieser Arbeit in der methylotrophen Hefe P. pastoris uberexprimiert und durch Ni2+-NTA-Affinitatschromatographie aufgereinigt. Nach Optimierung der Aufreinigungsbedingungen konnte -1,5 mg hP2X7 355-595-Protein in hoher Reinheit pro Liter Kulturmedium aufgereinigt werden. 2D-Kristallisationsversuche mit dem His-hP2X7 355-595-Protein wurden in Kooperation mit Prof. Schmidt-Krey an der Fakultat fur Biologie am Georgia Institute of Technology in Atlanta im Rahmen eines einjahrigen Aufenthalts durchgefuhrt. Durch die Optimierung der Kristallisationsparameter Lipid-Protein- Verhaltnis (LPR), Salz sowie Temperatur wurde die Ausbildung von DMPC- Membranstrukturen gunstig beeinflusst und eine Abnahme von zuvor vorhandenen Proteinaggregaten beobachtet. Nach elektronenmikroskopischer Auswertung der Proben zeigte sich, dass es durch DMPC-Zugabe, in einem Lipid-Protein-Verhaltnis von 1 bis 5, zu einer Stabilisierung des His-hP2X7 355-595-Proteins kommt. Durch Zugabe von NaCl zum Dialysepuffer konnte die Ausbildung von DMPC-Membranen gefordert werden. Eine Rekonstitution des His-hP2X7 355-595-Proteins in die DMPC-Doppelschicht und eine Ausbildung von kristallinen Bereichen konnte allerdings mit keiner der Parameterveranderungen mit Sicherheit beobachtet werden. Die Optimierung weiterer Kristallisationsparameter ist daher Gegenstand aktueller Untersuchungen. Expression und Reinigung von TMEM16A fur 2D-Kristallisationsexperimente Die TMEM16A/Anoctamin-Kanale konnten 2008 unabhangig von drei Arbeitsgruppen als lang gesuchte Ca2+-aktivierte Chloridkanale identifiziert werden. In unserer Arbeitsgruppe konnte mittels BN-PAGE-Analyse und Crosslinking-Experimenten erstmals gezeigt werden, dass das in X. laevis-Oozyten und HEK293-Zellen exprimierte TMEM16A-Protein stabil zu Homodimeren oligomerisiert und in homodimerer Form auch in der Plasmamembran dieser Zellen vorliegt (Fallah et al., 2010, Molecular & Cellular Proteomics,). Ziel der fortfuhrenden Arbeit war es, das TMEM16A-Protein in Milligramm-Mengen zu exprimieren und zu reinigen, um es fur strukturelle Untersuchungen mittels der 2D-Kristallisation verfugbar zu machen.